■文/李艳侠  贾荣菊  江 萍

   三聚氰胺（化学式：C3H6N6）呈弱碱性，能溶于甲醛、乙酸等，微溶于水和醇，不可用于食品加工或食品添加物。三聚氰胺可用于生产食品包装材料、农药和化肥，可能从环境、食品包装材料等途径进入到食品中，在产品中检出微量属于正常。三聚氰胺的含氮量为66％左右，常被不法商人添加到食品中，以提升检测中蛋白质的含量指标。

    原 理

   试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用高效液相色谱测定，外标法定量。

    仪器与试剂

    仪器高效液相色谱仪LC-20AD、电子分析天平（感量为0.0001g）、电子天平（感量为0.01g）、离心机、超声波清洗器、旋涡混合器、固相萃取装置、氮吹仪、真空泵、50mL具塞塑料离心管等。

    试剂与材料 试验用水均为重蒸水；甲醇、乙腈（色谱纯）；氨水、柠檬酸（分析纯）；辛烷磺酸钠：纯度大于98.0%；50％甲醇水溶液；1％三氯乙酸溶液；5％氨化甲醇溶液；离子对试剂缓冲液：准确称取2.10g 柠檬酸和2.16 g 辛烷磺酸钠，加入约980 mL 水溶解，调节pH 至3.0 后，定容至1L备用；三聚氰胺标准品：纯度大于99.0%；1mg/mL的三聚氰胺标准储备液（用1+1甲醇-水溶液溶解定容）；阳离子交换固相萃取柱：临用前依次用3 mL甲醇和5 mL水活化；微孔滤膜：0.2μm，有机相；氮气：纯度大于99.999%等。

    仪器工作条件

    色谱柱：C8柱，250 mm×4.6 mm，5μm（或C18三聚氰胺专用柱）；流动相：离子对试剂缓冲液-乙腈（90+10，V/V）；流速：1.0mL/min；柱温：40℃；波长：240 nm ；进样量：20 μL。

    分析方法

    1．标准曲线的绘制  用流动相将三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到的浓度为0.8、2、20、40、80 μg/mL 的标准工作液，以峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。

    2．样品的测定

    提取  称取2 g（精确至0.01 g）试样于50mL具塞塑料离心管中，加入15 mL1%三氯乙酸溶液和5 mL乙腈，超声提取10 min，再振荡提取10 min后，以11000r/min离心10 min。上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至25 mL，移取5 mL滤液，加入5mL水混匀后做待净化液。

    净化  将上一步骤中的待净化液转移至固相萃取柱（临用前已经活化）中。依次用3mL水和3 mL甲醇洗涤，抽至近干后，用6 mL5%的氨化甲醇溶液洗脱。整个固相萃取过程流速不超过1mL/min。洗脱液于50℃下用氮气吹干，残留物（相当于0.4 g样品）用1 mL流动相定容，涡旋混合1min，过微孔滤膜后，供HPLC测定。

   待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。

    实验结果

    1．LC-20AD高效液相色谱仪所测三聚氰胺标准曲线结果。三聚氰胺标准系列浓度为0.8、2.0、20、40、60μg/mL，三聚氰胺峰面积为59604，149686，1437010，2867212，4302082，相关系数R=0.9999995。

   2．精密度的试验。在不含三聚氰胺的奶样中分别加入浓度为１.０，１０.０，２０.０μg/mL的三聚氰胺标准溶液，每种浓度连续测定11次，测得结果的相对标准偏差分别为3.2%、1.8%、1.5%。

    3．加标回收率试验。在含三聚氰胺3.31%的奶样中分别加入浓度为2.0和10.0μg/mL的三聚氰胺标准溶液，测得加标后的样品浓度和为5.14和１3.08 μg/mL,三聚氰胺回收率为91.5%和97.7%。

    结果讨论

   1．离子对试剂缓冲液选择。离子对试剂选择庚烷磺酸钠要优于辛烷磺酸钠。一般来说，碳链短的比碳链长的分离度要好，而且碳链越长，离子对试剂和柱子的平衡时间越长，柱子越不易冲洗，对柱子损害越大。

   2．离子对试剂缓冲液pH值的选择。C8柱、C18柱使用的缓冲液pH值范围在2～7.5之间，太高的pH值，会使色谱柱硅胶溶解，太低的pH值，会使色谱柱键合的烷基脱落。所以离子对试剂缓冲液pH值选择3.0。

   3．流动相比例的选择。流动相（离子对试剂缓冲液和乙腈）的比例应根据仪器和选择的色谱柱作相应的调整，以达到最好的色谱分离。原则是尽量延长三聚氰胺的出峰时间，以便更好地分离杂质和目标物。乙腈含量一般控制在10%-20%，乙腈比例越大，出峰时间越快。经过多次试验，色谱柱用C18三聚氰胺专用柱，乙腈含量15%时，三聚氰胺标准出峰时间在8.5min左右；乙腈含量13%时，三聚氰胺标准出峰时间在10.3 min左右；乙腈含量10%时，三聚氰胺标准出峰时间在15.6min左右。乙腈含量10%，样品分离效果好。

    4．注意事项。

    ①离心机转速最好不低于8000 r/min，否则离心效果差，影响过滤效果。

   ②固相萃取柱在临净化前，一定要先活化，过柱时不能等流干之后再加溶剂，防止气泡进入，影响净化和萃取效果；控制整个萃取过程流速稳定且不得超过1mL/min（一般控制在25滴/分），否则影响去除杂质和洗脱三聚氰胺的效果。

   ③仪器的平衡：因为流动相中添加了一定量的离子对试剂，大概需要3h～5h仪器才能达到稳定的状态。

    ④分离：原则是尽量延长三聚氰胺的出峰时间，以便更好地分离杂质和目标物。

   ⑤样品分析时间：根据不同样品设定分析时间，因为很有可能上一针所进样品的杂质会在下一针出峰，而且保留时间会和三聚氰胺的出峰时间重叠，容易产生误判。例如用三聚氰胺专用柱，流动相比例为9010的情况下，三聚氰胺出峰时间在15 min左右，而在35 min左右还要出一个杂峰（在样品除脂不彻底时）。

   ⑥当检出阳性样品的峰不规则时，应认真判断是否是杂峰或是与杂峰重叠。方法是从样品瓶中转移出一部分样液，加标后再进针判断，或与有质谱的实验室进行比对。

    （作者单位：河北省藁城市质量技术监督局）